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光學顯微鏡觀察方式大盤點：暗場

暗場觀察（Dark field）是和明場觀察（Bright field）對應的一種觀察方式，其基本思路是屏蔽直射光，然后用散射光進行觀察，實現(xiàn)類似丁達爾效應的效果，揭示明場下無法觀察到的細節(jié)。星空可以說一種暗場觀察，星星一直都在，但在白天有太陽（直射光）的時候看不到，在晚上，不再有太陽直射光，星星的散射光在黑暗的背景下變得可見。

ML31暗場拍攝的木槿花粉

一、成像原理

透射暗場光路

暗場成像原理簡單，擋住直射光，只讓傾斜光照明樣品，樣品產(chǎn)生散射光，然后散射光通過物鏡成像。相比透射明場光路，透射暗場只是在光源到聚光鏡鏡片之間加入了暗場光闌，來擋住光源中間的直射光，形成傾斜光照明樣品。

簡易暗場聚光鏡產(chǎn)生倒置空心圓錐體照明

稍微復雜點說，暗場聚光鏡會產(chǎn)生倒置空心圓錐體照明，并將焦點集中在樣品平面上，在沒有樣品且聚光鏡N.A大于物鏡N.A的地方，傾斜光會相互交叉并錯開物鏡，形成暗背景；而經(jīng)過樣品的傾斜光會產(chǎn)生衍射、反射/折射，形成明亮的樣品圖像。

反射（落射）暗場光路

反射暗場光路原理跟透射暗場光路一致，只是結(jié)構(gòu)有些變化，除了多了個環(huán)形反射鏡產(chǎn)生反射照明，其物鏡前端也有特殊的反射結(jié)構(gòu)來反射聚光，這種物鏡就是BD明暗場物鏡。

暗場是一種很好的觀察方式，特別適合呈現(xiàn)樣品輪廓、邊緣、邊界和折射率梯度，暗場成像的分辨率可以超出物鏡數(shù)值孔徑計算的分辨率，完美狀態(tài)下暗場甚至能呈現(xiàn)直徑20-40納米的鞭毛之類細節(jié)，但實際上比較難實現(xiàn)。

二、關(guān)鍵部件

暗場觀察有簡易的，有專業(yè)。簡易的透射暗場非常簡單，加個暗場環(huán)（暗場光闌）即可。

專業(yè)的高倍暗場需要油浸式暗場聚光鏡、帶孔徑光闌的高倍物鏡；專業(yè)的金相暗場需要暗場反射模塊、明暗場物鏡。

·簡易透射暗場（40X以下）

ML31簡易暗場聚光鏡（阿貝聚光鏡+暗場環(huán)）

簡易暗場觀察只需在阿貝聚光鏡基礎(chǔ)上加入暗場環(huán)即可實現(xiàn)，這個暗場環(huán)通常安裝于聚光鏡底部，用推拉插板或者32mm濾光片托架安裝都可以，一般簡易暗場到N.A0.6效果都還行。也就是說最高搭配Plan 40X或者Plan Fluo 20X物鏡，更高N.A的物鏡可能需要在聚光鏡和玻片底部之間滴油來提升照明N.A.

用3D打印實現(xiàn)的暗場環(huán)插板和暗場環(huán)

暗場環(huán)核心是遮擋直射光的圓形擋板，周邊鏤空通光。在簡易暗場聚光鏡中，不同倍數(shù)物鏡匹配不同直徑的擋板，雖然高倍物鏡用大直徑擋板的暗場環(huán)也能觀察，但效果不佳，因為暗場觀察中要求聚光鏡照明N.A高于物鏡N.A，而暗場環(huán)遮擋越大，照明N.A越低，可能出現(xiàn)照明N.A太低而效果很差。

·專業(yè)透射暗場（20X-100X）

專業(yè)暗場聚光鏡

專業(yè)的暗場聚光鏡有很多種，特點是特殊結(jié)構(gòu)，帶來特別高的N.A.以UIS系統(tǒng)的U-DCW油浸式暗場聚光鏡為例，其照明N.A可以到1.2-1.4，可以使用20X以上，N.A1.2以下的高倍物鏡。這種聚光鏡使用比較費工夫，需要對中，并且滴油時不能有氣泡，否則暗場效果不佳。

暗場用的高倍物鏡

原則上，透射的暗場觀察無需特別的暗場物鏡，直接用普通物鏡即可。例外情況是100X物鏡，由于100X物鏡的N.A起碼都有1.25，而暗場照明要求照明N.A顯著大于物鏡N.A，因此連上述的U-DCW油浸式暗場聚光鏡都帶不動一個普通Plan 100X. 為了滿足暗場使用，部分100X物鏡會加入可變光闌，用來降低物鏡N.A，以匹配暗場聚光鏡N.A.

·專業(yè)反射暗場（金相）

暗場反射模塊（從物鏡端看）

在金相顯微鏡中，明場和暗場觀察切換是通過切換反射模塊實現(xiàn)的，以金相顯微鏡MJ43為例，明場反射模塊主要是一片45°的半透半反鏡片，而暗場反射模塊則是在此基礎(chǔ)上整合了暗場光闌、45°環(huán)形反光鏡和一些減少雜散光的光闌，具體不同品牌的暗場反射模塊結(jié)構(gòu)會有不同。

金相顯微鏡的明暗場物鏡

反射暗場必須搭配金相明暗場物鏡。金相明暗場物鏡要比普通物鏡粗很多，因為在金相反射暗場中，暗場照明光線并不通過物鏡聚焦到樣品上，物鏡主體以外要留出一圈空間給暗場照明的光通過，另外物鏡前端可以看到外殼是明顯向前端延申的，以讓暗場照明光傾斜反射到樣品上，在到達前端反射前，會有一圈環(huán)形的透鏡或棱鏡對光線進行調(diào)整。

三、成像特點

ML31暗場下的跳蚤：暗背景，豐富細節(jié)

透射暗場成像主要有三個特點：

1、暗背景亮樣品。暗場成像最明顯特點是暗背景、亮樣品，背景暗的程度與照明N.A和物鏡N.A的搭配情況相關(guān)，通常低于熒光成像或正交偏光成像。樣品會明顯比背景亮，且呈現(xiàn)完整、細節(jié)豐富。

2、顏色真實艷麗。暗場成像能真實反映樣品的色彩，同時因為背景暗樣品亮，會形成很好的對比度，讓樣品顏色比明場更真實艷麗。

3、瑕疵可見。暗場成像不僅能突出樣品細節(jié)，還能突出玻片灰塵、光路灰塵等瑕疵，在離焦面上形成大小不一的光斑，有時可能影響細節(jié)呈現(xiàn)，因此清潔光路和樣品對保障暗場成像質(zhì)量很重要。

MJ33下PCB明暗場對比成像

反射暗場成像特點與透射不太一樣，主要特點是：

1、暗平面亮凹凸。樣品平面部分的光線不會到達物鏡，因此會呈現(xiàn)為暗背景，而凹凸不平的地方則會形成散射，到達物鏡，比如氣孔、凸起、劃痕、灰塵等都會呈現(xiàn)出來。

四、主要應用

1、生物學領(lǐng)域

暗場觀察和熒光觀察檢查螺旋體①

用暗場顯微鏡檢測梅毒螺旋體、鉤端螺旋體等螺旋體是推薦的方法，因為儀器成本比相襯顯微鏡低，且在比較低倍觀察下就可以發(fā)現(xiàn)未經(jīng)染色的螺旋體的存在。

暗場（C）觀察單衣藻和口腔上皮細胞（D）②

暗場顯微鏡還可以用來觀察微生物運動和細節(jié)，比如在明場下單衣藻很難看出鞭毛等一些細節(jié)，而使用暗場觀察可以清晰看到鞭毛以及部分內(nèi)部細節(jié)。使用暗場觀察口腔上皮細胞，也可以看到細胞核等細節(jié)。

暗場下的硅藻

暗場顯微鏡還適合用于觀察一些微小生物，如水生生物、硅藻、小昆蟲、未染色的細菌、酵母、組織培養(yǎng)細胞和原生動物，此外骨、纖維、頭發(fā)也是暗場觀察的理想目標。

2、金相領(lǐng)域（材料學、工業(yè)等）

MJ43明暗場對比檢查芯片焊點

在金相領(lǐng)域，暗場觀察通常搭配明場觀察使用，來呈現(xiàn)明場觀察下無法發(fā)現(xiàn)的氣孔、凸起、劃痕、灰塵等瑕疵，比如檢查芯片焊點等芯片檢查工作。

MJ33暗場拍攝測量薄膜厚度

在一些孔隙率差異或折射率梯度的聚合物和陶瓷薄片，比如薄膜、光纖中，使用明場觀察會有邊緣模糊的問題，導致尺寸測量存在不準確的問題，使用暗場觀察可以更準確呈現(xiàn)邊緣，使尺寸測量更加準確。

五、明美產(chǎn)品推薦

1、生命科學推薦產(chǎn)品：生物顯微鏡ML31暗場配置

• 簡易透射暗場觀察，可快速切換明場暗場

• 10X/22大視野目鏡，更高工作效率

• 滿足40X-400X暗場觀察需要

• 適用于疾控螺旋體觀察、藻類等微小生物觀察

2、芯片質(zhì)檢和金相分析推薦產(chǎn)品：研究級金相顯微鏡MJ43-BD

• 研究級機身，支持明場、暗場、偏光觀察方式

• 可選半復消色差或復消色差BD明暗場物鏡

• 可擴展熒光觀察等其他觀察方式

• 適用于材料芯片、硅片、金相樣品等觀察和質(zhì)檢

3、金相分析推薦產(chǎn)品：倒置金相顯微鏡MJ42BD

• 倒置金相顯微鏡，工作空間更大

• 長工作距離平場消色差BD明暗場物鏡

• 支持明場、暗場、偏光觀察方式

• 適用于金相組織、礦物樣品的觀察

4、大樣品檢查和測量推薦產(chǎn)品：金相顯微鏡MJ31BD大臺面

• 超大載物臺，適合PCB等大尺寸樣品

• 可選消色差或半復消色差BD明暗場物鏡

• 支持明場、暗場、偏光觀察方式

• 適用于大片PCB等大尺寸樣品的觀察

①METHODS article,Front. Cell. Infect. Microbiol., 20 August 2019,Sec. Molecular Bacterial Pathogenesis,Volume 9 - 2019 | https://doi.org/10.3389/fcimb.2019.00287

②Charlotte K. Omoto，華盛頓州立大學，使用CH2教學顯微鏡拍攝

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