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顯微成像·洞察微觀之美

Microscopic imaging, insight into the beauty of micro

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您知道細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)該用什么顯微鏡看嗎？

發(fā)布時間：2025-11-18

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一、細(xì)胞生物學(xué)概念

細(xì)胞生物學(xué)是以細(xì)胞為研究對象，從細(xì)胞的顯微水平、亞顯微水平和分子水平三個層次，研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能和生活史。顯微結(jié)構(gòu)一般是指大概輪廓，大的結(jié)構(gòu)，如線粒體，葉綠體，細(xì)胞核等，其分辨力大于0.2微米，可在光學(xué)顯微鏡下觀察；亞顯微結(jié)構(gòu)是更具體的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜，核膜，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等，其分辨力小于0.2微米，受制于光學(xué)顯微鏡的衍射峰值，需用電子顯微鏡才能夠分辨，但電子顯微鏡不適用于活細(xì)胞成像，很多應(yīng)用研究也只需確定該亞顯微物質(zhì)的分布而無需明確具體結(jié)構(gòu)，因此通?？赏ㄟ^熒光標(biāo)記等方式使用寬場熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡等進(jìn)行研究。

明美顯微鏡相機(jī)MC50-S下的細(xì)胞成像

二、顯微成像技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)中的應(yīng)用

細(xì)胞生物學(xué)主要對細(xì)胞的生命活動進(jìn)行研究，包括生長、發(fā)育、繁殖、遺傳、變異、衰老、死亡、代謝、調(diào)控、分化等，使用光學(xué)顯微鏡可以進(jìn)行的研究內(nèi)容有以下幾種：①生物膜與細(xì)胞器；②細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；③細(xì)胞骨架體系；④細(xì)胞核、染色體及基因表達(dá)；⑤細(xì)胞增殖及其調(diào)控；⑥細(xì)胞分化及干細(xì)胞；⑦細(xì)胞死亡；⑧細(xì)胞衰老；⑨細(xì)胞工程。

這些研究都基于對細(xì)胞顯微水平及亞顯微水平的觀測：

（1）研究細(xì)胞顯微層面的形態(tài)、活動，如細(xì)胞遷移、胞吞、細(xì)胞的纖毛和鞭毛運動等

細(xì)胞一般呈透明狀，未經(jīng)染色的標(biāo)本或活細(xì)胞，適用于相差觀察，如活細(xì)胞培養(yǎng)（劃痕實驗、遷移實驗）

（2）細(xì)胞亞顯微水平的染色及熒光標(biāo)記觀測

細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)大小一般小于0.2微米，使用光學(xué)顯微鏡無法觀測其具體結(jié)構(gòu)，但可利用其結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)或核酸等物質(zhì)，選擇合適的熒光染料與其結(jié)合，通過熒光顯微鏡觀測熒光信號從而判斷該物質(zhì)的分布和活動。

MF53-N下的細(xì)胞有絲分裂

三、顯微成像技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)應(yīng)用中的挑戰(zhàn)

細(xì)胞生物學(xué)成像有以下幾個難點需要注意：

? 細(xì)胞的長時間活性和健康度需要培養(yǎng)條件支持。細(xì)胞的活性和健康度需要合適的溫度、濕度和氣體培養(yǎng)條件支持，離開了這些條件細(xì)胞無法長時間保持活性。如果觀察和實驗可以短時間完成，那么離開培養(yǎng)條件后盡快完成觀察和實驗即可。對于需要長時間觀察的細(xì)胞活動，則需要考慮把成像設(shè)備放到培養(yǎng)箱里，或者把培養(yǎng)皿放到成像設(shè)備上然后使用微流控細(xì)胞芯片分析儀等調(diào)節(jié)、保持培養(yǎng)條件。

（MF53-N+MSX2拍攝的細(xì)胞劃痕實驗狀態(tài)）

? 不合適的光源可能損傷細(xì)胞活性和健康度。高能量的激發(fā)光（如汞燈的紫外線）、高強(qiáng)度的光照（如共聚焦的激光光源）、長時間照射，會影響細(xì)胞的活率和健康度，這在傳統(tǒng)汞燈光源中比較明顯。使用LED冷光源的寬場熒光顯微鏡，做無需染色的相襯或者霍夫曼調(diào)制相襯觀察，是光源性損傷更低的方案，需要熒光染色時使用低光毒性的的長波段熒光染料（如cy5、cy5.5、cy7等），搭配盡可能低的光強(qiáng)和盡可能短的激發(fā)/成像時間，也是一種思路。

低光毒性的LED光源相襯觀察

? 熒光染料可能損傷細(xì)胞健康。熒光染料的毒性和激發(fā)光的光毒性會使細(xì)胞健康處于不良的狀態(tài)，典型的是DAPI和Hoechst，這些染料有一定的毒性，并且使用有光毒性的紫外光激發(fā)，對于這種情況，建議在染色后盡快實驗，并盡量縮短實驗時間。

? 不合適的熒光染料搭配會導(dǎo)致成像不理想。熒光染料不合適或過多，會導(dǎo)致光譜重疊、非特異性染色，背景信號會增強(qiáng)，影響熒光成像效果。為了避免這種問題，需要合理選擇染料的種類和數(shù)量，盡量錯開發(fā)射波段，并針對染料選擇合適的濾光片，通常使用窄帶發(fā)射濾光片會有更好的效果。另外還可通過加入適量背景試劑減少背景熒光。

? 熒光成像考驗相機(jī)的靈敏度。熒光成像屬于弱光成像，普通顯微鏡相機(jī)可能會出現(xiàn)成像時間長、背景噪聲高的問題，拍攝的圖片容易糊掉。使用高靈敏度的相機(jī)，可以降低成像時間，減少光毒性影響，并減少背景噪聲，這對于紫外成像和紅外成像來說更加明顯。對于650nm以上的紅外波段成像，還需要用到去除了藍(lán)玻璃/IRCF的sCMOS科研級相機(jī)（黑白）。

? 焦面漂移，觀察目標(biāo)可能會在實驗過程中因移動而失焦。具有自動聚焦功能的活細(xì)胞成像儀，可以幫助您保持更長的目標(biāo)聚焦時間并減少焦點漂移。另外，將細(xì)胞培養(yǎng)在恒定溫度并保持容器中溶液的體積恒定也有助于解決聚焦漂移問題

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