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顯微成像技術(shù)現(xiàn)在發(fā)展的越來越成熟，這些先進(jìn)的技術(shù)可以幫助我們在不同樣本類型和圖像應(yīng)用中捕獲到盡可能多的細(xì)節(jié)，提供了強(qiáng)大的助力，然而，隨著研究越來越復(fù)雜，顯微數(shù)字圖像檢測系統(tǒng)越來越多樣，我們需要對各種顯微相機(jī)的運(yùn)作方式有基本了解，以便適配并采納最佳解決方案以滿足成像需求。

因此，了解來自樣本的模擬信息是如何被處理成數(shù)字圖像以供存儲和展示這一過程的基本概念對于顯微鏡操作者來說較為重要。無論是比較要購買的相機(jī)，還是確定實(shí)驗(yàn)室或核心設(shè)施中哪個(gè)現(xiàn)有的顯微鏡最適合研究需求，都必須理解一些基本要素，選配合適的成像系統(tǒng)，來盡可能的獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)。

圖像捕獲方法：

光學(xué)顯微鏡的數(shù)字成像起點(diǎn)，是感知來自樣本不同區(qū)域的光子數(shù)量（信號強(qiáng)度）并準(zhǔn)確識別光子在樣本中的起始位置，其感知到的到達(dá)相機(jī)傳感器的信號是模擬格式，而相機(jī)必須將該模擬信號轉(zhuǎn)換為盡可能準(zhǔn)確表示模擬信息的數(shù)字信號。

對于數(shù)字成像，有兩種方法獲取模擬信號強(qiáng)度和位置信息。

第一種是幀圖像捕獲，其中來自目標(biāo)視場的光線同時(shí)投影到傳感器陣列上，陣列中每個(gè)傳感器捕獲來自樣本的一小部分信息，這些信息的陣列組合就形成了我們觀測視場的中的圖像

這種方式下，相機(jī)同時(shí)捕獲了光子信號的強(qiáng)度及其在樣本中的位置。（圖1）

圖1

另一種方法是點(diǎn)掃描圖像捕獲——將光聚焦到樣本的一個(gè)小區(qū)域并捕獲來自該小區(qū)域的信號（圖2）。

在這種方法中，光束通常在樣本上進(jìn)行光柵掃描以順序獲取所需的視場。在這里，傳感器只捕獲了傳入信號的強(qiáng)度，而其位置信息是從照明光束在樣本上的位置推斷出來的。

圖2

全幀圖像捕獲：

幀圖像捕獲系統(tǒng)的案例有不同類型的電荷耦合器件（CCD）和科學(xué)互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體（sCMOS）相機(jī)。

不管是CCD還是sCMOS相機(jī)，來自樣本的入射光子擊中光傳感器，其能量被轉(zhuǎn)換為電子（圖2）。

其產(chǎn)生的電子數(shù)量與捕獲的光子信號強(qiáng)度成正比。然后電子被轉(zhuǎn)換為電壓，由模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換器（ADC）讀取并數(shù)字化為代表傳入信號強(qiáng)度的灰度值。

然而，在超過一定的光子通量（每單位時(shí)間的光子強(qiáng)度）后，傳感器將無法產(chǎn)生額外的電子。

這個(gè)值，就是傳感器的滿阱容量，超過這個(gè)水平，傳感器就被認(rèn)為是飽和的。

為了準(zhǔn)確測量信號強(qiáng)度，信號必須保持在滿阱容量以下，最理想情況下是將其控制在最小可檢測信號和滿阱容量之間。

在這種類型的圖像捕獲中，單個(gè)傳感器的大小決定了圖像中的像素大?。ǚ直媛剩?，傳感器大小必須足夠小，才能捕獲由顯微鏡形成的圖像中最精細(xì)的細(xì)節(jié)。

冷卻CCD是使用傳感器陣列設(shè)計(jì)的兩種技術(shù)中較老的一種。在最簡易的CCD陣列實(shí)現(xiàn)中，落在每個(gè)傳感器（像素）上的光被轉(zhuǎn)換為電子。在曝光結(jié)束時(shí)，存儲在傳感器中的電子信號被順序地逐行轉(zhuǎn)移到讀出寄存器，然后逐幀放大并轉(zhuǎn)換為數(shù)字值（圖3）。

圖3

這個(gè)過程需要時(shí)間，從而會減緩相機(jī)的幀率。

目前已經(jīng)開發(fā)了幾種CCD處理的變體以增加靈敏度。行間冷卻CCD（圖4）是顯微鏡中使用最普遍的CCD類型。

圖4

#在傳統(tǒng)的冷卻CCD相機(jī)中，由獨(dú)立的傳感器收集的電子被順序地一行一行地傳輸?shù)酱凶x出寄存器中。從讀出寄存器，電荷被逐像素讀取，放大，并數(shù)字化為二進(jìn)制灰度值存儲在計(jì)算機(jī)存儲器中并隨后顯示。在行間CCD中，電荷首先從單個(gè)傳感器轉(zhuǎn)移到存儲寄存器中，然后從那里逐行讀出。這使得傳感器可以更快地開始收集另一個(gè)圖像。

對于CCD，像素電荷會被轉(zhuǎn)移到存儲寄存器中進(jìn)行讀取，而不是在開始新的曝光之前逐個(gè)像素地讀出其值，這樣做釋放了單個(gè)傳感器可以去進(jìn)行新的曝光。雖然這允許更快的周轉(zhuǎn)，但電荷存儲區(qū)域減少了芯片上可用于光收集的區(qū)域。目前大多數(shù)行間CCD使用微透鏡將入射光聚焦到傳感器區(qū)域，這在一定程度上緩解了阻擋光的問題。

盡管CCD在顯微鏡中仍有其用途，但在大多數(shù)應(yīng)用場景下，CCD已被sCMOS系統(tǒng)取代。在CCD陣列中，每個(gè)像素的信息通過一個(gè)輸出節(jié)點(diǎn)、放大器和數(shù)字轉(zhuǎn)換器傳輸，而對于sCMOS相機(jī)，像素是并行讀取的（圖5）。

圖5

他的每個(gè)傳感器都包含自己的電容器和放大器，每行像素都有自己的ADC。這以更低需求的功率實(shí)現(xiàn)了更快、更高效的讀取。

當(dāng)前sCMOS技術(shù)比CCD有許多優(yōu)勢，包括更寬的視場、更高的量子效率（QE）、更寬的動態(tài)范圍、更快的幀率和更好的功率效率。

另外，CCD和sCMOS的量子效率在所有波長上都不是均勻的。了解相機(jī)的光譜響應(yīng)對于數(shù)據(jù)解釋至關(guān)重要，特別是在熒光數(shù)據(jù)中，必須分離來自密切相關(guān)的光的波長的信號。

盡管sCMOS相機(jī)相較于CCD有一些優(yōu)勢，但并不能在所有場景下完全取代。

冷卻CCD比等效的sCMOS系統(tǒng)具有更少的暗電流噪聲，這種噪聲會在長時(shí)間曝光下累積，因此對于需要長時(shí)間曝光的、信號非常低的樣本，冷卻CCD將具有更好的信噪比閾值。這些類型的樣本包括生物發(fā)光研究、熒光素酶報(bào)告成像和基于化學(xué)還原的熒光。

像素大小影響傳感器的滿阱容量和相關(guān)的動態(tài)范圍。傳感器的動態(tài)范圍計(jì)算方式是總滿阱容量除以噪聲水平。因此一個(gè)滿阱容量為6000、噪聲水平為2e-的傳感器,將具有3000:1的動態(tài)范圍.從黑到白，它可以區(qū)分3000個(gè)單獨(dú)的光子通量水平，并將它們轉(zhuǎn)換為圖像中的3000個(gè)不同的灰度值；一個(gè)滿阱容量為34000、噪聲水平為2e-的傳感器將具有17000:1的動態(tài)范圍，這個(gè)相機(jī)相對具有更強(qiáng)大的能力，能夠清晰識別來自樣本不同區(qū)域的信號強(qiáng)度的更微妙的差異，使圖像具有更高的對比度分辨率。

點(diǎn)掃描圖像捕獲：

在點(diǎn)掃描圖像捕獲中，樣本被聚焦光束探測，記錄光束與樣本相互作用的信息。激光掃描熒光共聚焦顯微鏡是光顯微鏡中使用的主要點(diǎn)掃描系統(tǒng)。還有其他掃描熒光技術(shù)，但這些技術(shù)并不廣泛采用。

動態(tài)范圍和模擬數(shù)字轉(zhuǎn)換：

動態(tài)范圍是一個(gè)經(jīng)常被忽視的選擇相機(jī)的重要參數(shù)——相機(jī)系統(tǒng)還必須將原始動態(tài)范圍轉(zhuǎn)換為數(shù)字值，因此，必須了解相機(jī)的ADC能力。

大多數(shù)現(xiàn)代相機(jī)允許在數(shù)據(jù)收集期間選擇圖像的位深度，這是一個(gè)非常有用的特性。例如，12位圖像可以顯示從黑色到白色的全灰度作為4,096（212）個(gè)不同的灰度色調(diào)，而16位圖像可以存儲和顯示65,536（216）不同的灰度色調(diào)。

然而，16位圖像相對文件大小更大，而且讀取速度更慢，如果需要高速成像，應(yīng)選擇較低的位深度。相反，如果目標(biāo)是最大化對比度分辨率，特別是對于定量分析，應(yīng)使用更高的位深度。

除了位深度，還必須考慮相機(jī)傳感器能力。如果相機(jī)的動態(tài)范圍僅為4000:1，那么在超過12位（4,096灰度值）的對象進(jìn)行數(shù)字化純粹是浪費(fèi)時(shí)間和計(jì)算機(jī)內(nèi)存的。

熒光顯微鏡的相機(jī)要求：

熒光通常比明場的信號更弱，并且由于光毒性和光漂白，它并不適合長曝光時(shí)間。因此，選擇一個(gè)具有高靈敏度和低噪聲的相機(jī)進(jìn)行熒光顯微鏡檢查是很重要的。

具有低讀取噪聲和低暗電流噪聲的相機(jī)是熒光顯微鏡的理想選擇。由于每次捕獲圖像時(shí)都會發(fā)生讀取噪聲，讀取噪聲越低，可以在不降低圖像質(zhì)量的情況下使用的增益就越高。這允許更短的曝光時(shí)間，這有助于限制暗電流噪聲。暗電流噪聲與溫度和時(shí)間有關(guān)，通常以給定溫度下的每秒電子數(shù)表示。在弱信號的情況下，即使是最好的相機(jī)，動態(tài)范圍也會縮小。因此確定在典型數(shù)據(jù)采集條件下產(chǎn)生的動態(tài)范圍，將有助于確定在哪個(gè)位水平下執(zhí)行模數(shù)轉(zhuǎn)換。

幸運(yùn)的是，熒光圖像通常固有地具有較小的動態(tài)范圍，較低的動態(tài)范圍通常不會對圖像產(chǎn)生不利影響。

事實(shí)上，盡管了解了顯微相機(jī)的運(yùn)作模式和評估的關(guān)鍵參數(shù)，讓我們直接比較相機(jī)的數(shù)據(jù)并得出確切的結(jié)論并非易事，因此仍然推薦查看相機(jī)的參數(shù)后，在實(shí)際條件下去進(jìn)行相機(jī)試用測試，來確保能夠得出最佳的效果。

【文章來自MicroscopyEducation

Choosing the Best Camera System for Your Biological Light Microscopy Needs: Part II  W. Gray (Jay) Jerome

Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University, Nashville, TN  jay.jerome@vumc.org】

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